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題目中的干細胞專指間充質干細胞

2021-07-29 11:07


       細胞療法和再生醫學產品擁有非常獨特的產業鏈,在整個產業鏈上,細胞必須保持活力和功能。超低溫保存已成為再生醫學產品物流過程和供應鏈的重要組成部分。在培養液中運輸的活細胞只有很短的保質期。保存方法不佳容易限制了使用間充質干細胞(MSC)治療疾病的能力。比如Prochymal(MSC注射液)用于治療移植物抗宿主病,但在III期臨床試驗中失敗,細胞解凍后功能不佳是導致治療失敗的原因之一[1, 2]。
        當然,Prochymal(MSC注射液)的失敗,不僅僅有解凍后細胞功能下降的原因,還可能存在更多的原因,詳情請見本公眾號之前的分析文章《具有免疫抑制能力的MSC為何敗在治療GVHD的3期臨床試驗?
 
       凍存降低MSC的活率和功能低溫組織儲存研究的起源可以追溯到19世紀末[3]。MSC被使用之前,需要經過一系列的各種檢測,從而保證了MSC注射液的安全性。MSC作為種子細胞或者工作細胞,進行超低溫凍存,從而在時間上滿足各種檢測的需求。 
 
       不管MSC是作為種子細胞,還是直接制備成注射液的工作庫的細胞,要超低溫凍存MSC在-80度冰箱和液氮(液相/氣相液氮罐)中,都需要用到含有冷凍保護劑(CPA)的凍存液。這些冷凍保護劑可以保護細胞免受冷凍和解凍這兩個過程所帶來的損傷。
 
        MSC的應用,有2種常見的使用方式:(1),使用培養新鮮的MSC制備成干細胞注射液;(2),使用凍存的MSC直接制備成干細胞注射液。早些年,美國的干細胞公司多采用第2種使用方式,目前已經意識到這種方式的弊端。而我國更多的是采用第1種使用方式。這兩種使用方式各有優缺點。
 
       由于超低溫保存,MSC細胞活率會受到一定程度的影響,基本上都出現細胞活率下降[1, 4-8]。有的研究團隊采用的凍存方案(包括冷凍保護劑配方和凍存/復蘇的操作)會導致MSC低至44%的活率[1],這個44%的活率還不是最低的,還有更低的36%[5]。經過該凍存方案處理的MSC,出現臨床治療效果欠佳,大部分人沒意識到是凍存方案出問題。舉一個例子來說明這個問題:有一個手力很弱雞的人,用一把刀來砍樹,結果沒砍倒樹,然后狠狠地責備這把刀不能砍樹,其實就是選擇性忽視了自己手力的弱雞。當然,也有團隊在處理MSC凍存降低活率方面做的比較好,經過凍存處理,MSC復蘇后的活率可以均達到88%以上[8]。 
 
       直接采用液氮凍存的MSC,只是在臨床應用前進行解凍復蘇,然后直接給與MSC回輸治療,這樣的操作會導致MSC出現免疫抑制功能的嚴重下降[1, 2]。另一團隊也證實了MSC經過凍存后出現免疫抑制能力下降,即使細胞活率達到88%以上[8]。比較詭異的是,著名的卡羅琳斯卡大學醫院的某干細胞團隊,其MSC經過凍存后的活率也只有70%,但是卻通過實驗數據來證明“凍存”這個程序能提高MSC的免疫抑制能力[4]。經過凍存解凍后立刻回輸使用的MSC,更容易被體內的免疫細胞(T細胞)所殺傷,加速了機體免疫系統對輸入的MSC的清除[9]。凍存不僅會影響到MSC的活率和免疫抑制功能,而且還會誘導MSC出現一定程度的細胞衰老[7, 8]。
 
        一項系統性綜述比較了來自41個獨立研究的10個物種的骨髓MSC解凍后的評估報告,發現MSC的形態、免疫表型、分化和增殖潛力在很大程度上不受低溫保存的影響,但27%的研究報告存活率顯著降低[10]。因此,需要重視MSC的凍存對MSC應用療效的影響。    故,本文重點針對第2種使用方式做詳細的介紹,讓大家認識到第2種方式的致命缺陷,從而避免或者做出改良,進一步推動干細胞行業的發展。
 
       解凍4小時內,人骨髓MSC的細胞存活率稍微下降,細胞凋亡率增加(最高可達30%),代謝活性和黏附能力降低;解凍后24h,人骨髓MSC的細胞活力恢復,細胞凋亡率下降,但代謝活性和黏附能力仍低于新鮮細胞[11]。凍存和解凍后的細胞受到各種類型的壓力,導致細胞膜和細胞骨架發生變化[12]。有研究指出MSC解凍后黏附能力低,是因為MSC胞內的F肌動蛋白被破壞,而不是MSC細胞表面黏附分子脫落[13]
 
       有意思的是,在經歷了凍存和解凍之后,三個不同供體來源的骨髓MSC細胞之間出現明顯的生物學功能的差異,而這種變異可能與捐獻者的年齡和種族有關[11]。有研究提出,24小時的恢復期可能會使MSC恢復到更好的功能狀態[6, 11]。一般來說,MSC經過解凍復蘇后進入傳代培養階段,MSC的增殖能力和功能特性得到完美的恢復[14-16]。
 
       另外,在超低溫保存中,細胞在低溫等極端條件下會大量產生活性氧(ROS)[17],ROS造成的損害可歸因于脂質過氧化[18]、蛋白質氧化[19]和DNA損傷[20, 21]??寡趸瘎┡c冷凍保護劑聯合使用可提高冷凍保存效率,但濫用抗氧化劑可能會產生不良結果[22]。 
 
冷凍保護劑介紹

        常用的冷凍保護劑有2類:(1)滲透性冷凍保護劑,比如二甲基亞砜(DMSO)、甘油(GLY)、乙二醇(EG)或丙二醇(PG)等。目前常用的冷凍保護劑是二甲基亞砜(10%),在冷凍過程之前加入細胞培養液中,增加細胞膜的孔隙度,從而使水可以更自由地流過細胞膜,有助于防止胞內水晶體的形成[23-25]。(2)非滲透性冷凍保護劑,比如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、棉籽糖、蔗糖和海藻糖等。
 
        DMSO是最常用的冷凍保護劑。人骨髓MSC、豬脂肪MSC和犬骨髓MSC,在10%DMSO的保護下,能在液氮中長期保存數年而不影響MSC的功能特性[26-28]。所有被測試的冷凍保護劑都能夠維持羊水來源的MSC的表面標記表達、基因表達和分化,還發現了用DMSO或甘油凍存MSC比蔗糖或海藻糖有更高的活率[29]。在10%DMSO和10%自體血漿的凍存液中冷凍保存超過20年的骨髓細胞被解凍復蘇后,能培養出骨髓MSC,但是復蘇培養的細胞貼壁率僅為種子細胞的50%,繼續培養則MSC恢復正常功能狀態[30]。
 
       比較5%、10%和20%的DMSO凍存豬骨髓MSC的存活率、CFU-F,以及Bak和Bcl2的表達,結果是凍存MSC的存活率和CFU-F形成數與DMSO濃度成反比,經5%DMSO凍存的MSC存活率與對照組(新鮮MSC)相當,但是MSC在5%和10%的DMSO中的凍存效果無顯著差異[31, 32]。也有一篇文章提到DMSO的濃度可以降至2%,人脂肪MSC在解凍復蘇后的細胞活率可以維持在80%以上[33]。
 
       當然滲透性和非滲透性冷凍保護劑也可以一起組合使用,比如棉籽糖和DMSO組合冷凍哺乳動物卵母細胞,可以獲得較高的冷凍存活率、受精率和發育率[34];低濃度的乙二醇(EG)與DMSO組合提高了大鼠和人胰島細胞的產量、存活率和很好的保障了葡萄糖刺激的胰島素釋放的功能[35];還可以DMSO、乙二醇和蔗糖三者混合后凍存豬的囊胚[36]。如果MSC混合添加的DMSO的凝膠膠原支架,即使凍存在-80度的冰箱里,6個月的時間能維持90%以上的活率[37]。由4%DMSO+6%海藻糖+10%FBS組成的凍存液,人脂肪MSC細胞解凍后存活率可達80%以上[38]。同樣的凍存液配方(5%DMSO+2%PEG+3%海藻糖+2%BSA),對不同動物來源的MSC產生不同的影響(活率和代謝水平);相比較于大鼠和牛的MSC,這個凍存液配方更適合小鼠MSC[39]。
 
       常用的冷凍保護劑如DMSO對細胞有溫度、時間和濃度依賴性的毒性效應,并在患者中引發不良反應[40, 41]。尋找DMSO的無毒替代品,也是一個臨床應用所訴求的發展方向。1%脯氨酸和10%四氫甲基嘧啶羧酸(ectoin)組合凍存人MSC,具有和DMSO一樣的凍存效果(90%),只是比商品化的無DMSO冷凍溶液Biofreeze稍微遜色[42]。海藻糖、蔗糖、甘油、甘露醇和肌酸搭配組合凍存T細胞,也能達到80%左右的活率[43, 44]。無DMSO和無血清的凍存液,主要的冷凍保護劑是蔗糖、海藻糖和棉籽糖,輔助電穿孔技術(使得胞內的水得以流出胞外),凍存人臍帶MSC,MSC細胞的存活率最高為80%,MSC在解凍后24小時方可貼壁,但是胞內的空泡明顯增多[45]。
 
冷凍保護劑的保護原理

       添加了冷凍保護劑的凍存液,一般都是高滲透壓的。當細胞從生理溶液轉移到低溫保存溶液時,由于胞外溶液中的滲透壓較高,細胞會脫水,同時低溫保存溶液的小分子(如DMSO)擴散到細胞內時,細胞體積會緩慢減少;如果冷凍保存液中只有非穿透性冷凍保護劑(如葡聚糖和蔗糖),細胞也會脫水并保持脫水狀態,只是冷凍保護劑不能進入細胞內[46, 47]。在解凍復蘇階段,水從細胞外的低滲溶液迅速移動到細胞內的高滲透溶液,而小分子冷凍保護劑則向相反的方向緩慢移動,導致細胞體積膨脹,并達到細胞內外的滲透壓恢復平衡。所以,在細胞冷凍處理和解凍復蘇的過程中,稍有差錯,細胞就會因為滲透壓的過度變化,導致細胞膜破裂而死亡。這就是細胞的滲透壓力性損傷。 
 
        細胞冷卻凝固時,細胞內剩余的水量受冷卻階段水外流速率的影響,影響這一速率的三個變量是:細胞表面積與體積的比率、膜的透水性和冷卻速率[48]。也就是說,與較小細胞的脫水相比,較大細胞的脫水本質上是緩慢的。應根據細胞大小考慮冷凍保存期間的調整,以便在玻璃化發生之前有足夠數量的水退出??梢酝ㄟ^添加不同的冷凍保護劑來改變細胞膜的透水性。冷卻速度也是可以調整的。 
 
       冷凍保護劑通過加強氫鍵來改變水的低溫行為變化,包括:冰晶形態的變化,冰凍過程中的冰凍溫度和冰量[49, 50]。冷凍保護劑一般是高滲的,將細胞長時間置于冷凍保護劑中,可導致兩種獨立的損傷機制:滲透壓力和生物化學毒性[51]。
 
       滲透壓變化導致的細胞損傷,如前所述。含DMSO的冷凍保護劑,通??梢杂^察到DMSO對細胞活力的不良影響,這是由DMSO導致的生物化學毒性損傷。DMSO添加到冷凍保護劑溶液中會出現放熱現象,因此,需要提前配置和預冷冷凍保護劑溶液。為了在解凍后去除冷凍保護劑溶液,可以使用滲透壓稍高的洗滌液慢慢稀釋細胞,然后在必要時洗滌細胞[52]。因此,對于新的低溫保存液的開發,評估冷凍保護劑的生化毒性是至關重要的。理想情況下,冷凍保存溶液的成分應該是臨床級的。
 
細胞凍融的程序

        基本原則:慢凍速融即使細胞有冷凍保護劑的保護,在冷凍過程中,也需要非常注意溫度的下降程序??偟囊笫窃诶鋬鲞^程中,盡可能減少胞內冰晶的出現,即盡可能讓胞內流動的水通過滲透壓差的存在而流出胞外。實驗室的常規操作是經過4個溫度梯度的適應性過渡變化:4度、-20度、-80度、液氮。這種常規操作很難做到標準化和精準化?,F在可以通過使用可控速率的設備(程序降溫儀)來實現細胞環境能以穩定的1度/分鐘(或其他速率)的幅度來降溫。
       
       冷凍過程中,需要將細胞從冰箱或其他設備轉移到存儲液氮罐,在此轉移過程中,需要快速操作,避免細胞可能會迅速升溫而導致冷凍保護劑熔化,從而導致細胞損傷。由于滲透性冷凍保護劑通過氫鍵與水發生強烈的相互作用,水的冰點被降低,可與自身相互作用形成晶體所需的關鍵位點的水分子就會減少。
 
       凍存細胞的復蘇,必須給細胞迅速升溫,以防止冰的再結晶。解凍后細胞的活率取決于解凍過程中,細胞內和細胞外冰晶的數量和大小,因為胞內外的冰晶能直接刺破細胞膜和胞內亞器官。 
 
       常規做法是將樣品從儲存庫/冰柜中取出,浸泡在37攝氏度的水浴中,然后輕輕旋轉,直到冰消失,以實現最大的存活率[53]。用水浴解凍細胞有幾個明顯的局限性。由于技能或習慣的原因,不同的操作員可能不會以完全相同的方式執行解凍程序。減少解凍過程的可變性,需要訓練有素的操作員,并建立標準化的解凍程序。在水浴中解凍的細胞也有被污染的風險,因為水浴對環境是開放的。新的干式解凍裝置,可以克服水浴鍋中解凍細胞的限制,尤其適用于解凍有價值的細胞療法。
 
        解凍后洗滌是去除冷凍保護劑最常見的方法,即對細胞進行洗滌液或培養液重懸后離心,去除上清液,然后將細胞重新懸浮在洗滌液或培養液中。然而,需要注意的是,解凍后洗滌會造成凍存細胞的數量損失。
 
MSC注射液的低溫運輸

        MSC注射液的低溫運輸也是一個不可忽視的小問題,能影響到MSC在應用前的細胞活率。故而目前都建議MSC注射液(在人血清白蛋白的保護下)在24小時內使用[54]。人脂肪MSC在5°C的含海藻糖的保存液中24小時后,MSC的存活率可達95%[55]。人骨髓MSC含海藻糖的保存液中4度冷藏72小時后,MSC的存活率不到80%,但MSC的免疫抑制功能稍有下降[56]。MSC重懸在含40 mM海藻糖的細胞保存液中,4度環境下,MSC在7天的存活率保持在90%以上[57]。
 
        凍存的細胞,尤其是制備成注射液后的細胞,在運輸過程中可能會經歷各種應力,包括溫度波動、機械振動和沖擊以及壓力變化。減少樣品在運輸過程中的可變性和保持穩定性,需要全面的運輸考慮和制定經過驗證的運輸流程,即運輸流程盡可能地在經歷各種情況后不影響細胞的功能。
 
3D支架的聯合使用

       將MSC貼附在生物相容性材料制成的支架上進行冷凍保存,形成即用的移植單元,用于修復骨、軟骨或皮膚的損傷。常見做法是將MSC冷凍保存在海藻酸鹽微球中。海藻酸鈉是一種天然多糖,具有吸水性,通過吸收水分可以防止在凍結過程中形成大冰晶,良好的生物相容性和生物降解性。在10%DMSO的存在下,冷凍保存的海藻酸鹽包裹的MSC獲得了90%的解凍后存活率[58]。將臍帶來源的MSC接種于含10%DMSO的海藻酸鹽-明膠支架中,再凍存于液氮,但是復蘇后細胞死亡較多,而且24小時的增殖速度減慢[59]。
 
        在一項研究中,將一段臍帶(2-3厘米)浸泡在含有10%DMSO和0.2M蔗糖的培養基中,并以1/分鐘的速度冷卻到-80度,然后轉移到液氮中保存5~29天,組織解凍復蘇后能繼續培養出MSC,但是MSC增殖速度慢和細胞數量稀少[60, 61]。甚至也有報告臍帶組織經過含10%DMSO、5%甘油和20%FBS的凍存液冷凍保存在液氮后,未能從解凍復蘇的臍帶中培養出MSC[62]。相類似的,冷凍完整的牙齒中大約只有20%-30%經過解凍復蘇后培養出牙髓MSC[16, 63]。
 
總結

        理論上,MSC凍存在-196度的液氮里面(或氣相液氮),細胞所有的生命活動都是處于靜止狀態,那么細胞的生命能永恒保存,只要不出現液氮補充不及時等情況。
 
       雖然冷凍保存程序可能會影響幾個細胞過程,包括細胞存活、細胞功能、蛋白質表達、DNA完整性(表觀遺傳)、細胞骨架和核結構,但是相同的凍存方案對不同類型的細胞有不同程度和不同方面的差異化影響[64, 65]。
 
       除了凍存液配方,合適的凍存細胞濃度也是一個不可忽視的影響因素。幾項研究表明,較高的有核細胞濃度(高達2億個細胞/毫升)對低溫保存劑具有良好的耐受性,并可產生良好的臨床結果[66, 67]。也有專家建議人MSC的細胞凍存濃度為(2-25)x106/毫升[68]。這個細胞濃度的范圍,還是比較寬泛的。
 
       冷凍保存細胞的目的是保持細胞的關鍵生物學特性,以確保適當的解凍后功能,包括細胞完整性、代謝活性、增殖活性、分化潛力和治療功效的檢測[3, 69]。雖然使用膜完整性染料測量細胞的物理完整性是解凍后評估最廣泛的方法,但是用膜完整性作為衡量細胞存活率、功能的指標并不可靠,還應進行其他關鍵生物學特性的表征,如代謝活性、增殖活性或反映細胞功能的指標[70]。簡而言之,活力和功能檢測是確定解凍后細胞質量和提高當前冷凍保存方法效率的重要判斷指標。 
 
        細胞治療行業的規范化發展,涉及細胞運輸、細胞儲存、細胞供應的可用性以及質量控制的時間,都需要考慮到冷凍保存方案/程序應該在遵循GMP原則的同時提供大規模功能良好的細胞產品[65]。大容量程序化冷凍設備的發展和應用,能解決細胞的大規模凍存的工業化問題,和促進細胞治療行業的良好發展[71, 72]。


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